富血小板血漿在口腔頜面外科應(yīng)用的研究趨勢(shì)

日期：2013-08-29

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是自體源性、濃縮的含人血小板的血漿,是全血經(jīng)過(guò)離心、分離而得到的血小板濃縮物，亦稱(chēng)之為血小板凝膠、富生長(zhǎng)因子血小板或自體濃縮血小板。PRP富含由血小板分泌的七種與所有創(chuàng)傷愈合過(guò)程有關(guān)的蛋白生長(zhǎng)因子。這些生長(zhǎng)因子包括3種同分異構(gòu)體的血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGFαα,PDGFββ,PDGFαβ），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（TGF-β2），表皮樣生長(zhǎng)因子（EGF），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF），胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等［1，2］，它也含有血液中存在的3種蛋白質(zhì):纖維素、纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白［3］。這些因子對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化及組織的形成有著極其重要的作用。

　　1  富血小板血漿的制備及原理

    目前，PRP制備方法已明顯簡(jiǎn)化，在普通條件下于手術(shù)室即可以制備。但在離心過(guò)程中必須保持無(wú)菌，并且在沒(méi)有血小板溶解或破壞的高濃度下分離。不同的PRP儀制備的PRP結(jié)果不同。有些PRP儀不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的、促進(jìn)愈合的濃縮的血小板，這可以解釋許多關(guān)于使用PRP無(wú)效的研究。真正的PRP應(yīng)是自體的，因異體血小板沒(méi)有活力，且不能分泌生物活性生長(zhǎng)因子，其細(xì)胞膜亦是抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

    PRP制備方法大致分為兩類(lèi)。一類(lèi)通過(guò)手工操作，利用離心機(jī)等簡(jiǎn)單儀器在普通血庫(kù)條件下制備，易于開(kāi)展，但操作步驟較為繁瑣；另一種方法為使用專(zhuān)門(mén)的血液分離儀器自動(dòng)分離制備PRP。此法簡(jiǎn)單迅速，可將分離后剩下的血液成分及時(shí)回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。制備PRP時(shí)，需要在血液中加入抗凝劑，常用抗凝劑為10%檸檬酸鈉和EDTA。使用時(shí)，在PRP中加入凝集劑10%氯化鈣和凝血酶，使其形成凝膠，可起粘結(jié)作用；同時(shí)將生長(zhǎng)因子限制在凝集塊內(nèi)不易流失，有利于其發(fā)揮作用，且容易成形。

    不同的離心次數(shù)、離心力和離心時(shí)間制備的PRP中所含血小板濃度和活性同制備時(shí)的離心次數(shù)、離心力和離心時(shí)間有明顯因果關(guān)系，不同制備方法獲得的PRP中血小板的濃度為全血中的1.9~10倍［1，8，9］。其制備原理相同：即抽取全血，利用血液中各組分的沉降系數(shù)不同經(jīng)梯度離心，將血液分為3層，底層為沉降系數(shù)最大的紅細(xì)胞，最上層為上清液即乏血小板血漿（platelet-poor plasma,ppp），兩者交界處有一薄層（buffy coat），一般肉眼不易看出，即富血小板血漿層。然后提取上清液及交界處以下的一部分紅細(xì)胞，改變離心力再次離心，即可得到含有高濃度血小板的PRP。當(dāng)離心力大于250 g時(shí)，會(huì)過(guò)多破壞血小板；離心時(shí)間小于5 min時(shí)，PRP中血小板濃度與全血中血小板濃度無(wú)顯著差別。為此提示：離心以200 g離心力、10 min離心時(shí)間為最佳。也可將獲得的PRP進(jìn)一步濃縮，得到濃縮的PRP(concentrated platelet-rich plasma,cPRP),可以使血小板濃度進(jìn)一步提高至全血的16倍。

　　2  PRP可能的作用機(jī)制

    目前對(duì)于PRP促進(jìn)骨再生的機(jī)制尚未完全闡明?？赡艿淖饔脵C(jī)制是：PRP與凝血酶、氯化鈣混合形成凝膠，其中所含的血小板α顆粒釋放生長(zhǎng)因子而起作用。其中最重要的是PDGF和TGF-β。這些生長(zhǎng)因子在凝集十分鐘后開(kāi)始分泌，因此，PRP必須在凝集開(kāi)始后十分鐘內(nèi)、在抗凝狀態(tài)下制備并應(yīng)用。凝集時(shí)，血小板被激活，α顆粒與血小板膜融合，通過(guò)添加組蛋白及醣側(cè)鏈而成為活性狀態(tài)，生長(zhǎng)因子通過(guò)跨膜受體結(jié)合到細(xì)胞膜外表面。研究表明，成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞表達(dá)PRP中相關(guān)的生長(zhǎng)因子受體。這些跨膜受體反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)源性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白的活性，引起細(xì)胞增殖、血管生成、基質(zhì)形成、膠原合成等細(xì)胞的基因序列表達(dá)。PDGF為一種糖蛋白，可刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂，增加成骨細(xì)胞的數(shù)量；也可刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)受植區(qū)的毛細(xì)血管的生成；刺激單核巨噬細(xì)胞趨化。TGF-β可激活成骨前體細(xì)胞趨化及有絲分裂，刺激膠原基質(zhì)沉淀，抑制破骨細(xì)胞形成及骨吸收；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是強(qiáng)有力的血管生成因子，可促進(jìn)創(chuàng)口愈合及血管化。
    骨修復(fù)是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，而血小板在創(chuàng)口中的壽命僅有7 d，一旦顆粒耗盡，即相繼死亡。在生長(zhǎng)因子作用下的骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞的活性及數(shù)量增加，成骨細(xì)胞本身也分泌TGF-β作用于鄰近細(xì)胞及自身，形成良性循環(huán)。巨噬細(xì)胞也被血小板刺激后通過(guò)血管到達(dá)移植區(qū)，通過(guò)分泌巨噬細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子及其它因子承擔(dān)調(diào)節(jié)創(chuàng)口愈合的功能。

　　3  PRP 在口腔頜面外科的應(yīng)用

    頜骨由于其解剖及功能上的特殊性，其缺損的修復(fù)一直是口腔頜面外科臨床所面臨的難題之一。傳統(tǒng)的頜骨重建方法主要有自體骨移植、異體或異種骨移植、人工合成生物材料等,存在著骨源有限、傳播疾病、相容性及無(wú)誘導(dǎo)活性等缺陷。近期甚為活躍的組織工程化人工骨雖然有非常良好的應(yīng)用前景，但是由于存在種子細(xì)胞需分離純化、體外擴(kuò)增及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞方向分化等程序需時(shí)較長(zhǎng)，而支架材料的物理、化學(xué)性能、組織相容性及降解率等與種子細(xì)胞的復(fù)合尚缺乏有效的調(diào)控，生長(zhǎng)因子的適宜比例難以確定 ，故臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。因此，骨缺損的再生與重建是當(dāng)前的熱門(mén)研究課題之一。

    應(yīng)用PRP行頜骨缺損的重建是近期提出的一個(gè)研究方向,并且已有在頜面部根治性外科切除術(shù)后、頜骨重建、牙槽嵴裂的修復(fù)、牙種植外科及其它相關(guān)的骨科領(lǐng)域成功應(yīng)用的報(bào)道。

    在頜面部根治性外科切除術(shù)后遺留一些重要的硬組織及軟組織缺損。對(duì)這些缺損的修復(fù)主要是功能性修復(fù)。優(yōu)先的重建方法為：1）在手術(shù)切除時(shí)骨的穩(wěn)定及軟組織的重建；2）延遲進(jìn)行骨的定形重建，讓軟組織創(chuàng)口愈合。在手術(shù)過(guò)程中常規(guī)應(yīng)用PRP，當(dāng)軟組織分層縫合時(shí)，在組織下應(yīng)用一厚層的血小板凝膠，利用其凝膠的性質(zhì)止血及粘結(jié)組織瓣關(guān)閉創(chuàng)口，通過(guò)凝膠內(nèi)血小板的激活及前述的生長(zhǎng)因子產(chǎn)物的釋放促進(jìn)創(chuàng)口愈合。

    自體血小板凝膠復(fù)合顆粒松質(zhì)骨及骨髓（PCBM）壓縮在異體或異種支架內(nèi)，使移植物可獲得足夠的、充實(shí)的填充置入。除了可粘結(jié)軟組織瓣以外，凝膠內(nèi)的血小板還可釋放大量的生長(zhǎng)因子促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)的所有病例均能滿足Marx的下頜骨重建的成功標(biāo)準(zhǔn)。然而因受區(qū)軟組織切除后常造成與口腔交通，導(dǎo)致移植物繼發(fā)感染而失敗達(dá)35%。在這種情況下將穿通處采用荷包縫合，應(yīng)用一層PRP凝膠，可避免感染或移植失敗。應(yīng)用顆粒松質(zhì)骨及骨髓復(fù)合自體纖維素凝膠（autologous fibrin adhesive,AFA）重建腫瘤根除術(shù)后遺留的下頜骨節(jié)段性缺損。術(shù)后隨訪，全景片結(jié)果顯示骨重建在4周時(shí)顯著。用PRP干預(yù)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PRP加速骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，基質(zhì)細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞后的成骨活性較單純培養(yǎng)細(xì)胞高，分泌ALP及形成鈣鹽的能力強(qiáng)，細(xì)胞增殖及分裂數(shù)目顯著高于對(duì)照常規(guī)培養(yǎng)組。應(yīng)用復(fù)合PRP移植骨修復(fù)下頜骨缺損，結(jié)果復(fù)合PRP移植骨是單純移植骨修復(fù)速度1.62~2.16倍，骨密度為（74.0±11）%高于對(duì)照組骨密度（55.1±8%），（P<0.005）。

    應(yīng)用PRP復(fù)合多孔礦化牛骨誘導(dǎo)組織再生（PRP/BPBM/GTR）與GTR治療人牙周骨缺損，術(shù)后3周傷口完全愈合，PRP/BPBM/GTR組袋深度為2.83~2.89 mm, GTR組牙周袋深度為4.13~4.16 mm。臨床上皮附著水平PRP/BPBM/GTR組比GTR組增加為1.75~1.84 mm;齦退縮水平兩組間無(wú)明顯差別；PRP/BPBM/GTR 骨缺損充滿平均為4.66~4.78 mm,GTR組為2.26~2.31 mm,兩者間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    口腔種植技術(shù)常面臨的難題之一是局部骨量不足的問(wèn)題。嚴(yán)重的牙槽嵴萎縮常不能行種植體植入。垂直向的下頜骨萎縮可通過(guò)牽引成骨解決，牽引成骨期間成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖及分化，此過(guò)程依賴(lài)于局部血管化及足夠的血供。PRP中的PDGF可促進(jìn)骨生成，術(shù)后60 d時(shí)X線檢查新生骨有早期礦化的跡象；牽引器去除后可見(jiàn)未重建的編織骨，但可以維持種植體的穩(wěn)定。上頜后牙區(qū)牙槽骨高度不足時(shí)，行種植體植入時(shí)常易造成上頜竇底黏膜穿通致種植體周?chē)腥径?。此時(shí)應(yīng)用自體髂骨復(fù)合PRP竇底提升技術(shù)，同期行種植體植入與未復(fù)合PRP的竇底升高術(shù)相比愈合時(shí)間縮短了1/3。用Bio-Oss復(fù)合自體PRP上頜竇提升同期植入骨內(nèi)牙種植體， 4周時(shí)骨密度達(dá)到或超過(guò)鄰近正常骨密度，可以負(fù)載修復(fù)體，比沒(méi)有復(fù)合PRP的Bio-Oss時(shí)間縮短3~4倍。

　　4  PRP的應(yīng)用前景及存在的問(wèn)題

    PRP中含有高濃度的生長(zhǎng)因子，且完全是自體的，具有與體內(nèi)類(lèi)似的比例，滿足了早期骨愈合所需的生長(zhǎng)因子的需要；同時(shí)其自身所具有的粘合性有利于移植物的粘附、防止生長(zhǎng)因子的流失及骨骼的愈合與修復(fù)，而且使用方便。其生長(zhǎng)因子不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，使正常的愈合過(guò)程加速，無(wú)致畸作用,也不具有誘導(dǎo)腫瘤形成的能力。因此，復(fù)合PRP的移植骨是一種安全的、簡(jiǎn)便的、價(jià)廉的解決頜骨缺損、牙周骨缺損、種植前骨缺損修復(fù)的外科方法。

    由于PRP用于骨再生是近幾年才發(fā)展起來(lái)的，目前還存在許多尚待解決的問(wèn)題。首先，目前PRP制備尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，未能建立制備高效穩(wěn)定PRP制備方法；其次，不同方法制備PRP所含血小板數(shù)量差異很大，PRP中血小板數(shù)目與促進(jìn)骨再生最佳量效關(guān)系尚不能確定；還有， PRP中不同生長(zhǎng)因子的生物學(xué)特性、生物學(xué)作用及促進(jìn)骨再生的機(jī)制目前尚未完全闡明。有學(xué)者對(duì)PRP促進(jìn)骨再生的效果持懷疑態(tài)度。他們分別應(yīng)用PRP復(fù)合自體骨、Bio-oss、有機(jī)骨基質(zhì)等，未能得到PRP有效促進(jìn)骨再生的證據(jù)。因此，目前關(guān)于PRP還有許多尚待解決的問(wèn)題，在臨床應(yīng)用以前應(yīng)實(shí)行循證醫(yī)學(xué)，建立可靠的、可重復(fù)的動(dòng)物模型；然后設(shè)計(jì)嚴(yán)格的、標(biāo)準(zhǔn)化的人群試驗(yàn)。